HPLC og analysesertifikat: Slik vurderer du kvaliteten på et peptid

Alle seriøse peptidleverandører oppgir et analysesertifikat (CoA, certificate of analysis). Men et sertifikat er bare så godt som analysene bak det og din evne til å tolke dem. Her forklarer vi hva HPLC og massespektrometri måler, hva «99 % renhet» betyr og ikke betyr, hvilke urenheter som er vanlige, og hva du bør se etter.

Hvorfor trengs analyser?

Syntetiske peptider lages trinnvis ved fastfasesyntese, og hvert koblingstrinn har et utbytte som er litt under 100 %. Ved et peptid på 15–30 aminosyrer betyr det at råproduktet alltid inneholder et utvalg av nesten-like molekyler: kjeder der én aminosyre mangler, kjeder som er avkortet, og kjeder med rester av beskyttelsesgrupper. Produktet renses derfor, og analysene skal dokumentere at det som er igjen, er riktig molekyl i tilstrekkelig renhet. Bakgrunnen er forklart i aminosyrer og peptidbindinger.

HPLC: renhet

HPLC (high-performance liquid chromatography) pumper en løsning under høyt trykk gjennom en kolonne fylt med små partikler. For peptider brukes vanligvis revers-fase-HPLC, der kolonnen er vannavstøtende (ofte C18) og løsningen er en blanding av vann og acetonitril, gjerne tilsatt en liten mengde trifluoreddiksyre (TFA). Andelen acetonitril økes gradvis (gradient), og stoffene kommer ut av kolonnen til ulik tid (retensjonstid) avhengig av hvor sterkt de binder.

Deteksjonen skjer oftest med UV-lys ved 214–220 nm, der selve peptidbindingen absorberer. Resultatet er et kromatogram med topper. Renheten oppgis som arealet av hovedtoppen i prosent av summen av alle topper.

Det betyr at HPLC-renhet har klare begrensninger:

• Den sier noe om andelen UV-aktive urenheter, men ingenting om identiteten til hovedtoppen.
• Urenheter som kommer ut samtidig med hovedtoppen (koeluering), blir regnet som «rent» peptid.
• Stoffer som ikke absorberer UV-lys ved målebølgelengden, som vann og salter, er usynlige.
• Tallet avhenger av metoden: kolonne, gradient og hvordan toppene integreres. To laboratorier kan få ulike tall for samme prøve.

Typiske urenheter i syntetiske peptider

Flere av disse urenhetene kan også oppstå etter produksjon, ved feil oppbevaring. Se oppbevaring av peptider.

Massespektrometri: identitet

MS måler masse-til-ladning-forholdet til ioniserte molekyler og bekrefter at peptidets molekylvekt stemmer med den teoretiske. For peptider brukes vanligvis elektrosprayionisering (ESI), ofte koblet direkte til HPLC (LC-MS), eller MALDI. Ved ESI får peptidet gjerne flere ladninger, slik at spekteret viser flere topper som må regnes om til én masse.

Uten MS vet man ikke at hovedtoppen i HPLC faktisk er riktig peptid. Et CoA som kun viser HPLC, men ikke MS, mangler derfor halve beviset. Når du leser et MS-resultat, bør målt og teoretisk masse stå side om side, og avviket bør være lite og forklart. Vær oppmerksom på at det finnes to måter å oppgi masse på – monoisotopisk og gjennomsnittlig – og at de gir ulike tall for samme molekyl.

MS har også begrensninger. Molekyler med samme masse, for eksempel peptider der to aminosyrer har byttet plass eller der én aminosyre har gått over til D-form, kan ikke skilles med en enkel massemåling. Da kreves fragmentering (MS/MS) eller andre metoder.

Renhet er ikke det samme som innhold

Frysetørkede peptider inneholder også vann og motioner (for eksempel acetat eller trifluoracetat) som ikke vises på UV-kromatogrammet. Motionene er nødvendige for å nøytralisere ladede aminosyrer, og jo flere basiske aminosyrer et peptid har, desto mer motion inneholder pulveret. «Netto peptidinnhold» er derfor ofte rundt 70–85 % av innveid masse, selv om HPLC-renheten er 99 %.

Netto peptidinnhold bestemmes med aminosyreanalyse (peptidet brytes ned til aminosyrer som måles kvantitativt) eller med nitrogenanalyse. Vanninnhold måles ofte med Karl Fischer-titrering, og motioner med ionekromatografi.

Et regneeksempel: 5 mg pulver med 99 % HPLC-renhet og 75 % netto peptidinnhold inneholder omtrent 5 × 0,75 × 0,99 ≈ 3,7 mg av det riktige peptidet. Det betyr at en «5 mg»-ampulle ikke nødvendigvis inneholder 5 mg ren peptid. Seriøse leverandører oppgir hvordan innholdet er definert og bestemt. For ferdigblandede løsninger er det tilsvarende spørsmålet hvilken konsentrasjon som er målt, og med hvilken metode.

Endotoksin og sterilitet

Endotoksiner er bestanddeler fra celleveggen til gramnegative bakterier. De kan gi feber og betennelsesreaksjoner selv i små mengder, og de er varmestabile og fjernes ikke av vanlig sterilfiltrering. For produkter som skal brukes parenteralt, måles endotoksin vanligvis med LAL-testen (Limulus amebocyte lysate), beskrevet i Den europeiske farmakopé, kapittel 2.6.14. Sterilitet er noe annet: det betyr fravær av levende mikroorganismer, og testes etter egne metoder (kapittel 2.6.1). Et CoA som oppgir endotoksin, sier altså ikke automatisk noe om sterilitet, og omvendt.

Hva et CoA bør inneholde

Slik leser du et CoA, steg for steg

1. Sjekk at batchnummeret på sertifikatet er det samme som på produktet du har.
2. Kontroller at sekvensen eller CAS-nummeret stemmer med peptidet du forventer.
3. Se på kromatogrammet: er det én dominerende topp, og er de små toppene integrert og oppgitt?
4. Sammenlign målt og teoretisk masse i MS-resultatet.
5. Se etter netto peptidinnhold eller målt konsentrasjon, ikke bare renhet.
6. Sjekk analysedato, metode og laboratoriets navn, og om laboratoriet kan kontaktes.
7. For produkter til parenteral bruk i forskning: se etter endotoksin og sterilitet.

Røde flagg

• Samme sertifikat for alle batcher, eller uten batchnummer
• Kun et ferdig tall «99 %» uten kromatogram
• Ingen MS-data, eller MS uten oppgitt teoretisk masse
• Renhet på nøyaktig 100,0 %, som er urealistisk for syntetiske peptider
• Gammel dato, uleselig bilde eller tegn på redigering
• Laboratorium som ikke kan finnes eller verifiseres
• Kromatogram som ser identisk ut for ulike peptider

Vanlige misforståelser

• «Høyere renhet er alltid bedre.» Over et visst nivå er det viktigere hvilke urenheter som finnes og om de er identifisert, enn om tallet er 98 eller 99 %.
• «HPLC-renhet viser hvor mye peptid det er i ampullen.» Nei, det viser andelen av de UV-aktive stoffene. Innhold krever egne analyser.
• «Et CoA fra produsenten er det samme som uavhengig testing.» Et produsent-CoA er et utgangspunkt, men et uavhengig laboratorium gir en kontroll uten økonomiske interesser.

Hva et CoA ikke kan fortelle

Et analysesertifikat dokumenterer identitet og renhet i én batch på ett tidspunkt. Det sier ingenting om hvordan produktet er oppbevart og transportert etter analysen, og det sier ingenting om biologisk effekt. Et peptid kan være 99 % rent og likevel mangle dokumentert effekt i mennesker. Kvalitet og evidens er to separate spørsmål – det siste behandles i hvordan lese en peptidstudie. Formatet har også betydning for stabiliteten, se peptidpenn vs hetteglass.

Uavhengig testing

Det sterkeste beviset er testing hos et uavhengig laboratorium som ikke har økonomiske bånd til leverandøren. En typisk uavhengig analyse omfatter HPLC-renhet og MS-identitet, eventuelt også innhold. Det er en fordel om prøven sendes fra et uåpnet produkt og at batchnummeret noteres, slik at resultatet kan knyttes til riktig produksjon. Du kan også be leverandøren om å få se rådata eller kromatogramfiler. Les mer om rammene for kjøp i kjøpe peptider i Norge og om håndtering i oppbevaring av peptider.

Ofte stilte spørsmål

Kilder og videre lesning

1. European Pharmacopoeia. General chapter 2.2.29 Liquid chromatography.
2. European Pharmacopoeia. General chapter 2.6.14 Bacterial endotoxins.
3. D'Hondt M. et al. Related impurities in peptide medicines. J Pharm Biomed Anal 2014;101:2–30.
4. Fosgerau K, Hoffmann T. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discov Today 2015;20:122–128.
5. Aguilar MI (red.). HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, bd. 251. Humana Press, 2004.

Relaterte guider